图2. Calcein和PI-DNA的激发光谱和发射光谱。

使用说明：
1.Calcein AM/PI检测工作液的配制:
按照96孔板每孔100μl Calcein AM/PI检测工作液的体系，参考下表配制适量的Calcein AM/PI检测工作液，并充分混匀。

注1：为得到比较理想的结果，可根据细胞类型和实际染色效果对Calcein AM (1000X)和PI (1000X)在500-2000稀释倍数之间进行适当调整。
注2：配制好的Calcein AM/PI检测工作液必须一次使用完毕，不能冻存。
注3：也可以用其它合适的溶液，如无血清培养液、

HBSS (C0218)

或

PBS (C0221A

/C0221D)

稀释Calcein AM (1000X)。本试剂盒配套提供的检测缓冲液可在一段时间内维持细胞的正常状态，并给细胞提供一定的营养，效果通常比PBS或HBSS更好。
2.荧光显微镜检测：
a.接种培养。将细胞接种于96孔板等多孔板、细胞培养皿中或者细胞爬片上，按实验设计对细胞进行一定处理。
b.洗涤(选做)。对于贴壁细胞，吸除培养液，用PBS洗涤细胞1遍；对于悬浮细胞，250-1000×g室温离心5min，吸除上清，用PBS洗涤1遍。酚红或血清对于本试剂盒的检测有一定的干扰，吸除培养液和PBS时最好使用真空泵。在能充分吸净残留液体的情况下，可以不使用PBS洗涤。
c.染色。加入适当体积的Calcein AM/PI检测工作液。通常96孔板每孔加入100μl，24孔板每孔加入250μl，12孔板每孔加入500μl，6孔板每孔加入1ml。37℃避光孵育30min。不同的细胞最佳孵育时间有所不同，以30min作为初始孵育时间，后续可以根据实际染色效果对染色时间进行适当调整和优化，以得到更加理想的染色效果。
d.检测。孵育结束后，在荧光显微镜下观察染色效果(Calcein AM为绿色荧光，Ex/Em=494/517nm；PI为红色荧光，Ex/Em=535/617nm)。对于贴壁细胞HT-29，本产品的荧光染色效果参考图1。如有需要，也可进一步进行其它荧光的复染，例如使用

Hoechst 33342活细胞染色液(C1027

/C1028

/C1029)

染色细胞核等。注意整个过程均需注意避光操作。
3.流式细胞仪检测：
a.细胞准备。贴壁细胞胰酶消化后用培养液重悬，并用PBS洗涤一次；悬浮细胞250-1000×g室温离心5min，弃上清，用PBS洗涤一次。每个样品推荐的细胞用量为10⁶个细胞。
b.染色。对于上一步骤的106个细胞的沉淀，加入1ml Calcein AM/PI检测工作液，重悬为单细胞悬液。37℃避光孵育30min。注：需要准备好仅含缓冲液的细胞样品用作流式细胞仪检测时的阴性对照，该缓冲液与配制Calcein AM/PI检测工作液的缓冲液宜保持一致。同时准备两管额外的细胞样品，每管只加入一种染料(Calcein AM或PI)，用于流式单染的补偿调节。
c.检测。孵育完成后，可以直接进行流式细胞仪检测，也可以250-1000×g室温离心5min沉淀细胞，吸净液体后每个样品加入0.5ml缓冲液重悬细胞后用流式细胞仪检测(Calcein AM为绿色荧光，Ex/Em=494/517nm；PI为红色荧光，Ex/Em=535/617nm)。如有需要，也可进行进一步染色，例如使用

Hoechst 33342活细胞染色液(C1027

/C1028

/C1029)

染色细胞核等。注意整个过程均需注意避光操作。染色后，将样品置于冰上，并尽量在1小时内进行流式细胞仪检测和分析。
注1：使用仅含检测缓冲液的并且未经染色的细胞样品用于流式细胞仪的阴性对照设置。
注2：细胞圈门(gate)时，注意不要圈入细胞碎片，并使用Calcein AM或PI单染的细胞进行调节补偿。双染细胞流式检测应获得两个相对独立的细胞群：绿色荧光的活细胞群和红色荧光的死细胞群。
注3：由于流式检测比较灵敏，使用的荧光探针浓度可能要比荧光显微镜检测时要低，此时可根据细胞类型和实际染色情况对Calcein AM或PI的稀释倍数进行适当调整。
4.荧光酶标仪检测细胞死活的变化：
a.接种培养。将细胞接种于96孔板黑色多孔板中，如

BeyoGold™全黑96孔细胞培养板(FCP966)

，每孔的细胞数需要控制在100-10,000个，通常宜在2000-5000个范围内。按实验设计对细胞进行一定处理。
b.洗涤(选做)。对于贴壁细胞，吸除培养液，用PBS洗涤细胞1遍；对于悬浮细胞，250-1000×g室温离心5min，吸除上清，用PBS洗涤1遍。酚红或血清对于本试剂盒的检测有一定的干扰，吸除培养液和PBS时最好使用真空泵。在能充分吸净残留液体的情况下，可以不使用PBS洗涤。
c.染色。加入适当体积的Calcein AM/PI检测工作液，通常96孔板每孔加入100μl。37℃避光孵育30min。不同的细胞最佳孵育时间有所不同，以30min作为初始孵育时间，后续可以根据实际染色效果对染色时间进行适当调整和优化，以得到更加理想的染色效果。
d.检测。孵育结束后，用荧光酶标仪检测(Calcein AM为绿色荧光，Ex/Em=494/517nm；PI为红色荧光，Ex/Em=535/617nm)。通过对比对照组与处理组的RFU (Relative fluorescence values)，可以得出死细胞与活细胞数量的变化。
5.荧光酶标仪检测细胞死活的比例：本方法通过设置对照，可计算出死细胞与活细胞的比例。
a.细胞培养和处理同前。
b.除配制Calcein AM/PI检测工作液外，还需要配制单独的Calcein AM检测工作液和PI检测工作液用于对照的检测。配制方法和稀释倍数与Calcein AM/PI检测工作液的配制一致。
c.检测样品组和对照组设置：
对于下面组别的细胞或无细胞组，需要保持细胞数量、检测工作液浓度、孵育时间和孵育温度的完全一致。

活细胞组为没有加入药物处理的细胞；死细胞组可用0.1-0.5%

洋地黄皂苷(ST1272)

或0.1%皂素处理细胞10分钟，或70%乙醇孵育细胞30分钟即可得到死细胞。
d.染色和检测步骤同前。
e.根据检测数据计算死细胞与活细胞的比例：
% Live Cells =F(517)_sam-F(517)_min
F(517)_max-F(517)_min×100%
% Dead Cells =F(617)_sam-F(617)_min
F(617)_max-F(617)_min×100%
注1：其中所有的F(517)和F(617)都减去相应的F(517)₀和F(617)₀。
注2：如果需要确定活细胞与死细胞的具体数量，可制作不同数量活细胞与死细胞在517nm和617nm处的荧光光谱标准曲线。该标准曲线呈线性关系，因此通过标准曲线和样品中两个染料的荧光强度可计算出活细胞与死细胞的数量。
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