使用说明：
1.样品的准备：
方法一：LDH释放检测
a.根据细胞的大小和生长速度将适量细胞接种到96孔细胞培养板中，使待检测时细胞密度不超过80-90%满。
b.吸去培养液，用PBS液洗涤一次。换新鲜培养液(推荐使用含1%血清的低血清培养液或适当的无血清培养液)，将各培养孔分成如下几组：包括无细胞的培养液孔(背景空白对照孔)，未经药物处理的对照细胞孔(样品对照孔)，未经药物处理的用于后续裂解的细胞孔(样品最大酶活性对照孔)，以及药物处理的细胞孔(药物处理样品孔)，并做好标记。按照实验需要给予适当药物处理如加入0-10μl左右特定的药物刺激，可设置不同浓度，不同处理时间，对照孔中需加入适当的药物溶剂对照)，继续按常规培养。到预定的检测时间点前1小时，从细胞培养箱里取出细胞培养板，在“样品最大酶活性对照孔”中加入试剂盒提供的LDH释放试剂，加入量为原有培养液体积的10%。加入LDH释放试剂后，反复吹打数次混匀，然后继续在细胞培养箱中孵育。
c.到达预定时间后，将细胞培养板用多孔板离心机400g离心5min。分别取各孔的上清液120μl，加入到一新的96孔板相应孔中，随即进行样品测定。
方法二：细胞内总LDH的检测
a.细胞毒性检测：根据细胞的大小和生长速度将适量细胞接种到96孔细胞培养孔板中，使待检测时细胞密度不超过80-90%满。加入不同药物进行处理，并设置适当对照。药物刺激完毕后，将细胞培养板用多孔板离心机400g离心5min。尽量吸除上清，加入150μl用PBS稀释了10倍的试剂盒提供的LDH释放试剂(10体积PBS中加入1体积LDH释放试剂并混匀，适当摇晃培养板混匀，然后继续在细胞培养箱中孵育1小时。随后将细胞培养板用多孔板离心机400g离心5min。分别取各孔的上清液120μl，加入到一新的96孔板相应孔中，随即进行样品测定。
b.细胞增殖检测：根据细胞的大小和生长速度将适量细胞接种到96孔细胞培养孔板中，使促进细胞增殖的药物刺激后细胞不超过80-90%满为宜。使用不同的药物刺激细胞，并设置适当对照。药物刺激完毕后，将细胞培养板用多孔板离心机400g离心5min。尽量吸除上清，加入150μl用PBS稀释了10倍的试剂盒提供的LDH释放试剂(10体积PBS中加入1体积LDH释放试剂并混匀)，适当摇晃混匀胞，然后继续在细培养箱中孵育1小时。随后将细胞培养板用多孔板离心机400g离心5min。分别取各孔上清液120μl，加入到一新的96孔板相应孔中，随即进行样品测定。
注：LDH释放检测更加常用一些，细胞内总LDH检测通常可以使用MTT、WST-1或CCK-8等方法替代。
2. 试剂盒的准备工作：
a.INT溶液(1X)的配制：根据所需的INT溶液(1X)的量，取适量INT溶液(10X)用INT稀释液稀释至1X。例如，取20μl INT溶液(10X)，加入180μl INT稀释液，混匀后即配制为200μl INT溶液(1X)。INT溶液(1X)宜现配现用，配制后4ºC保存可于当天使用，不宜配制后冻存。
b.LDH检测工作液的配制: 根据待测定的样品数(含对照)，参考下表在临检测前新鲜配制适量的检测工作液。
注意：LDH检测工作液必须现配现用，配制和使用过程中均要注意适当避光。

检测次数	1次	10次	20次	50次
乳酸溶液	20μl	200μl	400μl	1ml
INT溶液(1X)	20μl	200μl	400μl	1ml
酶溶液	20μl	200μl	400μl	1ml
总体积	60μl	600μl	1.2 ml	3ml

c.(选做)如果希望进行LDH酶活性的绝对定量，需自备LDH标准品，并新鲜配制不同浓度LDH标准品，如250mU/ml、125mU/ml、62.5mU/ml、31.25mU/ml、15.6mU/ml、0 mU/ml。
3. 样品测定:
a.各孔分别加入60μl LDH检测工作液。
b.混匀，室温(约25℃) 避光孵育30min(可用铝箔包裹后置于水平摇床或侧摆摇床上缓慢摇动)。然后在490nm处测定吸光度。使用600nm或大于600nm的任一波长作为参考波长进行双波长测定。
c.计算(测得的各组吸光度均应减去背景空白对照孔吸光度)
d.细胞毒性或死亡率(%)=(处理样品吸光度－样品对照孔吸光度) / (细胞最大酶活性的吸光度－样品对照孔吸光度)×100
e.可绘制细胞毒性曲线：纵座标为实际吸光度，横坐标为药物浓度；据此可计算该药物作用特定时间的半致死剂量LD50。

附录1：
可同时测定一已知浓度的LDH酶标准品对应的吸光度值，参考以下公式粗略计算出样品中LDH酶活力：
待测样品中LDH活力单位(mU/ml)＝
(样品孔吸光度－背景空白对照孔吸光度) / (标准管吸光度－标准空白管吸光度)×标准品浓度(mU/ml)；
根据计算结果可以比较不同样品处理组间有无统计学差异等。

附录2：
若需准确计算出LDH酶活性的绝对活性，可通过一系列LDH标准品及相应测得的吸光度值绘制标准曲线，通过标准曲线相应公式计算出样品中LDH的酶活性。
各孔数值减去空白对照后，以检测的吸光度(OD490)为纵坐标，LDH酶活力(mU)为横坐标，绘制LDH标准曲线(如图2所示)。同时计算出该趋势线的公式。

图2. 碧云天乳酸脱氢酶细胞毒性检测试剂盒(

C0016

/

C0017

)对LDH标准品的检测结果。实际检测数据会因检测仪器、实验条件等的不同而存在差异，本图仅供参考。

A_490nm＝k×LDH酶活力单位(mU)＋b，通过Excel等软件计算出趋势线的斜率k和截距b。
根据上述公式计算样品中LDH活力。
样品实际吸光度(OD490)＝样品孔测得的吸光度－背景空白对照孔吸光度
检测体系中LDH酶活力单位(mU)=(OD490-b)/k
样品中LDH酶活力(mU/ml)＝检测体系中LDH酶活力单位(mU )/检测样品体积