保存温度：本品分为AB包装。A包：2-8℃/RT（常温运输）；B包：-20℃。

产品内容：

注意：I型超声裂解法（PTE006）和II型酶解法（PTE007）均适用于可溶性和包涵体中His标签蛋白的纯化。

产品说明：

  本试剂盒是基于Ni亲和层析的蛋白质纯化方法进行His标签蛋白纯化的试剂盒；变性和非变性条件均可使用，也适用于纯化包涵体中的His标记蛋白。最大载量为20-30 mg His标记蛋白质/mL介质。本试剂盒可满足10次His蛋白纯化（50 mL体积的细菌)。

操作步骤：

一、装柱

1.将Ni-Agarose介质充分混匀后，取适量加入到预放了一片筛板的层析柱中。

注意：介质用量需要根据His蛋白产量决定，请根据实验需要取适量的Ni-Agarose介质加入层析柱。

2.用5倍柱体积（指填料的体积，下同）自备去离子水洗柱，共三次。

3.用5倍柱体积的洗涤液洗柱，共三次。

4.室温5,000 g离心10 min收集50 mL表达菌液，弃上清，沉淀放冰上待用或放-80℃保存。最好用不加诱导物的菌液做对照。

注意：以下成分均以50 mL菌液计算用量，实际用量可根据菌体量增减。

二、裂解

1）超声破碎细菌：加入2.5 mL冰浴的超声裂解缓冲液，再加入60 μL PMSF（10 mg/mL）溶液，冰上超声裂解菌体直到在显微镜下看见绝大多数细胞破裂。超声参数需根据仪器型号自行摸索，但裂解物必须不粘稠，否则会堵塞层析柱。

2）酶法裂解细菌：加入2.5 mL冰浴的酶解液，再加入60 μL PMSF（10 mg/mL）溶液，震荡混匀，冰上放置30分钟。4℃下13,000-15,000 g离心10 min，去除残留细胞和细胞碎片以防堵柱，收集上清，留样做SDS-PAGE电泳对照。可溶的His蛋白在上清液中，包涵体的His蛋白在沉淀中。

三、纯化

A 纯化可溶性His标记蛋白

1.将上步得到的上清液上柱，用层析柱的底端的盖子盖上，让细菌裂解液和介质在4℃结合0.5-12 h后取掉盖子，自然重力下让裂解液自然流出。

2.用10倍柱体积洗涤液洗柱，收集并保存穿透液（含杂质或没被吸附的His标记蛋白，可做SDS-PAGE电泳的对照）。

3.按下表配置含不同浓度咪唑的洗脱液，以确定His标签蛋白的最适洗涤液的咪唑浓度。按从低到高的顺序洗涤并收集样品，SDS-PAGE电泳检测His标记蛋白所在的区域。

注意：建议咪唑浓度梯度为：40、70、100、200、300、400、500 mM。

4.如已知咪唑洗脱浓度，可直接配置该浓度的洗脱液进行洗脱。

5.洗脱后，依次使用10倍柱体积的去离子水洗涤柱子，再用3倍柱体积的20%乙醇平衡（乙醇要将填料浸没），最后堵住层析柱下端的漏口，4℃保存待下次使用。

B 纯化包涵体中 His 标记蛋白

1.将包涵体沉淀重悬于2 mL包涵体变性洗涤液。冰浴1 h以使包涵体溶解，期间可轻柔摇晃几次。

2.室温10,000 g离心20 min，沉淀为未溶解的包涵体。将上清（含溶解后的His标记蛋白）以自备的针头过滤器（0.45 μm）过滤。

3.将滤过液上柱，用层析柱底端的盖子盖上，让细菌裂解液和介质在4℃结合0.5-12 h后取掉盖子，自然重力下让裂解液自然流出。

4.用10倍柱体积包涵体变性洗涤液洗柱，收集并保存穿透液（含杂质或没被吸附的His标记蛋白，可做SDS-PAGE电泳的对照）。

5.按下表配置含不同浓度咪唑的变性洗脱液，以确定His标签蛋白的最适洗涤液的咪唑浓度。按从低到高的顺序洗涤并收集样品，SDS-PAGE电泳检测His标记蛋白所在的区域。

C 纯化已复性的包涵体蛋白

1.将可溶性蛋白溶液，按照纯化细胞裂解液中可溶性His标记蛋白操作。

四、再生（自备试剂）

  纯化相同的蛋白质可以纯化5-7次后再进行再生，再生的凝胶最好用于相同蛋白的纯化。凝胶最多再生3-4次，一次或多次再生后，凝胶的蛋白结合能力会有所下降，并且非特异性结合也会升高。

具体步骤如下：

1.5倍柱体积的去离子水洗柱一次。

2.1倍柱体积的25%、50%、75%乙醇各洗柱一次。

3.5倍柱体积的100%乙醇洗柱一次。

4.1倍柱体积的75%、50%、25%乙醇各洗柱一次。

5.2倍柱体积的去离子水洗柱一次。

6.2倍柱体积的200 mM EDTA (pH 8.0)，洗柱一次。

7.5倍柱体积的去离子水洗柱一次。

8.3倍柱体积的50 mM NiSO4洗柱一次。

9.3倍柱体积的非变性裂解液洗柱一次。

10.加入3倍柱体积的去离子水洗柱一次。

11.随后把凝胶存放在20%乙醇中，4ºC保存。